Elettroforesi su gel di agarosio, come funziona e suoi usi

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Semplici leggi della fisica impongono che quando la corrente viene applicata a un mezzo contenente specie cariche, tali specie migreranno verso la carica opposta. A seconda del mezzo attraverso il quale si muovono, altre caratteristiche – come la dimensione delle specie presenti – possono influenzare il loro movimento, portando alla separazione. Questa è la base su cui vengono costruite le tecniche di elettroforesi, come l’elettroforesi su gel di agarosio, tecniche ampiamente utilizzate nelle scienze della vita.

In questo articolo considereremo come funziona l'elettroforesi su gel di agarosio, come può essere interpretata e alcuni dei suoi scopi.

L'elettroforesi è una tecnica che utilizza la corrente elettrica per separare DNA, RNA o proteine ​​in base alle loro proprietà fisiche come dimensione e carica.

L'elettroforesi su gel di agarosio è una forma di elettroforesi utilizzata per la separazione di frammenti di acido nucleico (DNA o RNA) in base alla loro dimensione. Il DNA/RNA carico negativamente migra attraverso i pori di un gel di agarosio verso l'estremità caricata positivamente del gel quando viene applicata una corrente elettrica, con i frammenti più piccoli che migrano più velocemente. Le bande risultanti possono quindi essere visualizzate utilizzando la luce ultravioletta (UV).

L’RNA,1, tuttavia, tende a formare strutture secondarie – a volte più specie diverse per lo stesso frammento – che influenzano il modo in cui migra. Di conseguenza, le bande osservate non sempre rappresentano le loro dimensioni reali e le immagini sono sfocate. I gel di agarosio nativi (dove le condizioni non interrompono le strutture naturali degli analiti) tendono quindi a non essere utilizzati per l'analisi delle dimensioni dell'RNA, sebbene possano fornire una stima della quantità e dell'integrità. Le alternative includono il Northern blotting e l'elettroforesi su gel di agarosio2 denaturante che utilizzano condizioni in grado di distruggere le strutture secondarie.

I gel di agarosio possono essere utilizzati anche per separare le proteine3 in base alla loro dimensione e carica (a differenza del DNA/RNA, le proteine ​​variano in carica a seconda degli amminoacidi incorporati). Tuttavia, a causa delle grandi dimensioni dei pori nei gel di agarosio, le proteine ​​vengono spesso separate sui gel di poliacrilammide che hanno invece pori più piccoli, offrendo una maggiore risoluzione per le piccole molecole proteiche.

Ci concentreremo quindi sull'elettroforesi su gel di agarosio del DNA per il resto di questo articolo.

L'agarosio è un componente dell'agar. Forma una matrice gel 3D di molecole elicoidali di agarosio in fasci superavvolti tenuti da legami idrogeno, con canali e pori attraverso i quali le molecole possono passare. Quando riscaldati, questi legami idrogeno si rompono, trasformando l'agarosio in liquido e permettendone il versamento in uno stampo prima che si ripristini (Figura 1).

La percentuale di agarosio inclusa in un gel influisce sulle dimensioni dei pori e quindi sulla dimensione delle molecole che possono attraversarlo e sulla velocità con cui lo fanno. Maggiore è la percentuale di agarosio, minore è la dimensione dei pori, quindi minori sono le molecole in grado di passare e più lenta la migrazione. Nel laboratorio di biologia molecolare, il gel di agarosio allo 0,7-1% viene generalmente utilizzato per le separazioni quotidiane del DNA, offrendo una buona e chiara differenziazione dei frammenti nell'intervallo di 0,2-10 kb. I frammenti più grandi possono essere risolti utilizzando gel con una percentuale inferiore, ma diventano molto fragili e difficili da maneggiare, mentre i gel con una percentuale più elevata forniranno una migliore risoluzione dei frammenti piccoli ma sono fragili e potrebbero fissarsi in modo non uniforme.

L'elettroforesi su gel viene utilizzata per separare miscele di biomacromolecole, come DNA, RNA e proteine. Questa tecnica separa in base alla dimensione molecolare e/o alla carica. Ciò si ottiene attirando le molecole attraverso un gel contenente minuscoli pori utilizzando un campo elettrico.

Poiché il DNA non è visibile ad occhio nudo, durante la solidificazione nel gel viene incorporato un colorante intercalante come il bromuro di etidio (EtBr). Questo lega il DNA e diventa fluorescente alla luce UV, consentendo la visualizzazione dei frammenti di DNA. Più DNA è presente, più luminosa sarà la banda.